熒光定量PCR儀引物設計的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段，使其能有效地擴增模板DNA序列。因此，引物的優(yōu)劣直接關系到PCR的特異性與成功與否。
　　要設計引物首先要找到DNA序列的保守區(qū)。同時應預測將要擴增的片段單鏈是否形成二級結(jié)構(gòu)。如這個區(qū)域單鏈能形成二級結(jié)構(gòu)，就要避開它。如這一段不能形成二級結(jié)構(gòu)，那就可以在這一區(qū)域設計引物。
　　現(xiàn)在可以在這一保守區(qū)域里設計一對引物。一般引物長度為15~30堿基，擴增片段長度為100~600堿基對。
　　讓我們先看看P1引物。一般引物序列中G+C含量一般為40%~60%。而且四種堿基的分布好隨機。不要有聚嘌呤或聚嘧啶存在。否則P1引物設計的就不合理。應重新尋找區(qū)域設計引物。
　　同時熒光定量PCR儀引物之間也不能有互補性，一般一對引物間不應多于4個連續(xù)堿基的互補。
　　引物確定以后，可以對引物進行必要的修飾，例如可以在引物的5′端加酶切位點序列；標記生物素、熒光素、地高辛等，這對擴增的特異性影響不大。但3′端不能進行任何修飾，因為引物的延伸是從3′端開始的。這里還需提醒的是3′端不要終止于密碼子的第3位，因為密碼子第3位易發(fā)生簡并，會影響擴增的特異性與效率。
　　綜上所述可歸納十條熒光定量PCR儀引物的設計原則：
　　1.引物應用核酸系列保守區(qū)內(nèi)設計并具有特異性。
　　2.產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)。
　　3.引物長度一般在15~30堿基之間。
　　4.G+C含量在40%~60%之間。
　　5.堿基要隨機分布。
　　6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
　　7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
　　8.引物5′端可以修飾。
　　9.引物3′端不可修飾。
　　10.引物3′端要避開密碼子的第3位。